基因測序儀一種用于確定DNA分子中核苷酸（即腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、鳥嘌呤G）精確排列順序的核心生命科學(xué)儀器。隨著基因組學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)療、病原體檢測和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展，基因測序儀已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究與臨床診斷中不可或缺的關(guān)鍵裝備。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

從技術(shù)路線來看，目前主流的基因測序儀主要基于邊合成邊測序、邊連接邊測序或單分子實(shí)時(shí)測序等原理，但無論哪種技術(shù)路徑，其核心檢測環(huán)節(jié)大多依賴于熒光信號的光學(xué)檢測。熒光檢測法具有靈敏度高、多重檢測能力強(qiáng)、信噪比優(yōu)良等優(yōu)勢，因此成為基因測序領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的信號讀取方式。在熒光檢測體系中，光學(xué)濾光片作為光路系統(tǒng)的核心波長選擇元件，其性能直接決定了測序信號的采集質(zhì)量、堿基識別準(zhǔn)確率以及最終數(shù)據(jù)產(chǎn)出的可靠性。

一、基因測序儀工作原理

1.基本工作流程

以主流的邊合成邊測序（SBS）技術(shù)為例，其基本工作流程如下：

文庫制備：待測DNA片段經(jīng)處理后連接接頭序列，形成測序文庫，并固定在流動(dòng)池（FlowCell）表面。

橋式擴(kuò)增：在流動(dòng)池表面進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，形成成千上萬個(gè)單克隆DNA簇，每個(gè)簇包含大量相同的DNA模板拷貝，以增強(qiáng)后續(xù)熒光信號強(qiáng)度。

邊合成邊測序：加入帶有熒光標(biāo)記的可逆終止核苷酸（每個(gè)堿基對應(yīng)一種特征熒光染料），在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)。每輪延伸只摻入一個(gè)堿基后即停止，隨后通過光學(xué)系統(tǒng)讀取該堿基的熒光信號。

信號讀取與堿基識別：激發(fā)光源照射DNA簇，熒光染料發(fā)出特征波長信號，經(jīng)光學(xué)濾光片分光后由高靈敏度探測器（如CCD或CMOS相機(jī)）捕獲，通過分析信號波長和強(qiáng)度確定當(dāng)前摻入的堿基類型。

循環(huán)重復(fù)：切除熒光標(biāo)記和終止基團(tuán)，進(jìn)入下一輪延伸與讀取循環(huán)，直至完成全部序列測定。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

2.熒光檢測的光學(xué)原理

在測序反應(yīng)中，四種堿基（A、T、C、G）通常采用四色熒光標(biāo)記體系，即每種堿基標(biāo)記一種發(fā)射光譜特征不同的熒光染料。測序儀的光學(xué)系統(tǒng)需依次完成以下功能：

激發(fā)：光源（通常為固態(tài)激光器或多波長激光器）發(fā)出特定波長的激發(fā)光，照射樣本中DNA簇上的熒光染料分子，使其躍遷至激發(fā)態(tài)。

發(fā)射：熒光染料從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出波長更長的特征熒光信號。

分離與檢測：光學(xué)系統(tǒng)將混合的熒光信號按波長進(jìn)行分離，由探測器分別捕獲各波長通道的信號強(qiáng)度，經(jīng)算法解碼后判定堿基類型。

在這一過程中，光學(xué)濾光片是決定波長選擇精度和信號分離效果的關(guān)鍵元件。

二、測序儀光學(xué)系統(tǒng)核心元件

基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)主要包括以下核心元件：

1.激發(fā)光源

通常采用固態(tài)激光器或多波長激光器，輸出功率穩(wěn)定、線寬窄、光束質(zhì)量高的激發(fā)光。根據(jù)熒光染料的吸收光譜特征，常選用不同波長的激光器組合，以高效激發(fā)多種熒光染料。

2.光學(xué)濾光片組

這是整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的核心波長管理元件，通常以"濾光片組"的形式配套使用，具體包括：

激發(fā)濾光片：位于激發(fā)光源與樣本之間，用于提純激發(fā)光的波長。

二向色鏡：以特定角度（通常為45度）放置于光路交匯處，用于分離激發(fā)光與發(fā)射光。

發(fā)射濾光片：位于樣本與探測器之間，用于篩選目標(biāo)熒光信號、阻擋雜散光。

3.聚焦與成像光學(xué)元件

包括物鏡、透鏡組、反射鏡等，用于將激發(fā)光匯聚至樣本，并將發(fā)射的熒光信號高效收集、準(zhǔn)直和成像到探測器靶面上。

4.光電探測器

通常采用科學(xué)級CCD（電荷耦合器件）、sCMOS（科學(xué)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體）相機(jī)或光電倍增管（PMT），用于將光信號轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行量化記錄。

（NBP473窄帶濾光片）

三、光學(xué)濾光片及其關(guān)鍵參數(shù)分析

基因測序儀對光學(xué)濾光片有著極高的性能要求，以下從常規(guī)應(yīng)用參數(shù)維度進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1.激發(fā)濾光片（ExcitationFilter）

功能定位：位于激發(fā)光光路中，用于從寬光譜光源中提取特定波段的激發(fā)光，同時(shí)徹底濾除光源中與激發(fā)無關(guān)的其他波長成分，防止非目標(biāo)波長光進(jìn)入樣本區(qū)域產(chǎn)生背景干擾。

常規(guī)應(yīng)用參數(shù)要求：

中心波長（CWL）：需與所使用的熒光染料吸收峰精確匹配，常規(guī)中心波長常見于473nm、532nm、635nm、685nm等激光譜線附近，依據(jù)具體染料體系而定。

帶寬（FWHM，半高全寬）：通常為3nm～10nm，較窄的帶寬有助于保證激發(fā)光的高度單色性，減少非特異性激發(fā)。

峰值透射率：典型值要求大于90%，以最大化激發(fā)光能量利用率，降低光源功率需求。

截止深度（光密度OD值）：在截止波段要求OD≥5，有效阻擋光源的雜散發(fā)射和背景輻射。

截止波長范圍：通常覆蓋200nm～1200nm的寬光譜范圍。

（NBP635窄帶濾光片）

2.發(fā)射濾光片（EmissionFilter）

功能定位：位于樣本與探測器之間的發(fā)射光路中，用于選擇性地透過熒光染料發(fā)射的特征信號光，同時(shí)最大程度地阻擋激發(fā)光及其他雜散光到達(dá)探測器，是決定信噪比的核心環(huán)節(jié)。

常規(guī)應(yīng)用參數(shù)要求：

中心波長（CWL）：需與熒光染料的發(fā)射峰精確對應(yīng)，常規(guī)發(fā)射中心波長常見于510nm、570nm、670nm、710nm等位置，具體取決于熒光染料體系。

帶寬（FWHM）：通常為10nm～35nm。帶寬選擇需兼顧信號收集效率（帶寬越寬信號越強(qiáng)）和光譜分辨能力（帶寬越窄鄰道串?dāng)_越小），在主流四色體系中通常折中選擇在15nm～30nm區(qū)間。

峰值透射率：典型值要求大于90%，部分高性能濾光片可達(dá)95%以上，以最大限度保留微弱的熒光信號。

截止深度（光密度OD值）：這是發(fā)射濾光片最為關(guān)鍵的參數(shù)之一。在激發(fā)光波長位置及非目標(biāo)熒光波段，要求OD≥6，對于高靈敏度系統(tǒng)甚至要求OD>8，以確保激發(fā)的雜散光被充分抑制。

陡度（EdgeSteepness）：定義為透射帶邊緣從高截止到高透射的波長過渡寬度，通常要求過渡帶寬度小于5nm，以保證在激發(fā)光波長與發(fā)射光波長非常接近時(shí)仍能有效分離。

截止波長范圍：覆蓋200nm～1200nm，確保全光譜范圍內(nèi)無漏光。

（BP670帶通濾光片）

3.二向色鏡（DichroicMirror）

功能定位：以45度入射角放置在激發(fā)光路與發(fā)射光路的交匯點(diǎn)。其鍍膜設(shè)計(jì)使其對短波長（激發(fā)光）具有高反射率，對長波長（發(fā)射光）具有高透射率（或反之），從而實(shí)現(xiàn)激發(fā)光與發(fā)射光在空間上的分離。

常規(guī)應(yīng)用參數(shù)要求：

截止/分界波長：位于激發(fā)光中心波長與發(fā)射光中心波長之間的中間區(qū)域，典型分界波長如500nm、580nm、650nm等，需針對具體染料對進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

反射率：在激發(fā)光波長處要求反射率大于90%，部分可達(dá)到95%以上，以確保激發(fā)光高效反射至樣本。

透射率：在發(fā)射光波長處要求透射率大于90%，確保熒光信號高效透過到達(dá)探測器。

角度敏感性：由于其性能對入射角變化敏感，常規(guī)應(yīng)用中要求在45°±2°范圍內(nèi)性能指標(biāo)保持穩(wěn)定。

（500二向色鏡）

4.多通道濾光片組的協(xié)同工作

在基因測序儀中，上述三類濾光片并非獨(dú)立工作，而是構(gòu)成一個(gè)精密匹配的光學(xué)濾光片組。激發(fā)濾光片、二向色鏡和發(fā)射濾光片三者的光譜特性需協(xié)同設(shè)計(jì)，確保：

激發(fā)濾光片的透射帶與二向色鏡的反射帶重疊；

二向色鏡的透射帶與發(fā)射濾光片的透射帶重疊；

發(fā)射濾光片的截止帶與激發(fā)濾光片的透射帶及二向色鏡的反射帶重疊，實(shí)現(xiàn)多重阻擋。

五、濾光片參數(shù)對測序性能的影響

光學(xué)濾光片的各項(xiàng)參數(shù)直接關(guān)系到基因測序儀的核心性能指標(biāo)

光學(xué)濾光片作為基因測序儀光學(xué)檢測系統(tǒng)的核心波長管理元件，通過激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向色鏡的精密組合，實(shí)現(xiàn)了對熒光激發(fā)和發(fā)射信號的高效、高選擇性控制。其中心波長、帶寬、透射率、截止深度、陡度等關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)，直接決定了測序儀的信號靈敏度、信噪比和多色串?dāng)_抑制能力，最終影響堿基識別準(zhǔn)確率與數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量。

隨著基因測序技術(shù)向更長讀長、更高通量、更快速檢測和更低成本的方向持續(xù)演進(jìn)，對光學(xué)濾光片在光譜精度、環(huán)境穩(wěn)定性、批次一致性及膜系可靠性等方面的要求也將不斷提升。精密光學(xué)濾光片設(shè)計(jì)與制造技術(shù)的進(jìn)步，將持續(xù)為基因測序技術(shù)的發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的光學(xué)基礎(chǔ)支撐。